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荧光定量PCR(Q-PCR)技术
来源:    作者:    发布时间:2017/7/18 13:12:30

1.       实验前需要确认的信息

1.1.      客户提供样本的数量、编号、种属、样本来源部位。

1.2.       样本类型(细胞或组织等)

1.3.      保存条件。

1.4.      检测方法。

1.5.      检测指标。

1.6.       上样顺序

1.7.      试剂是否齐全,仪器是否可用。

 

2.        实验开始前需要准备试剂

 

试剂名称

试剂用途

RNA抽提试剂

TRIZOL

裂解细胞,释放RNA

氯仿(CHCl3

使有机相和无机相迅速分离,萃取RNA

异丙醇

沉淀RNA

75%乙醇

(DEPC水和无水乙醇配)

清洗RNA,去除杂质

红细胞裂解液

去除红细胞

DEPC

溶解RNA沉淀

逆转录相关试剂

dNTP Mixture(10mM)

DNA聚合酶的底物

RTase M-MLV(RNase H-)

RNA反转录酶

RNasin  Inhibitor40units/μl

RNA抑制剂

Random Primer

随机引物

Q-PCR反应相关试剂

SYBR Premix Ex Taq

荧光染料

Deoxyribonuclease I (DNase I)

DNA

 

3.       Q-PCR实验操作流

3.1.            实验原理(简单描述)

通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,可通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。

3.2.            实验总体注意事项

3.2.1.     为得到最佳的实验结果,实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能,避免将核酸从一个实验带入下一个实验。以下措施有助于避免实验污染问题:

3.2.2.      用稀释的漂白剂或净化剂以及75%酒精抹擦工作台。

3.2.3.     在配有紫外灯的超净室、罩式或台式超净台中准备样品

3.2.4.      在样品准备和配制反应液过程中必须带手套并及时更换手套。

3.2.5.      使用专门的移液器和枪头,勤用稀释的漂白剂清洁移液器。

3.2.6.      只使用PCR级的水和PCR专用试剂进行PCR实验

3.2.7.      枪头灭菌后存放于超净台中,若在超净台外使用过后不可再放回使用

3.2.8.     除了注意以上事项,在进行PCR实验时,还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生。

3.2.9.      为最小化实验结果的统计学偏差,先制备混合反应液,在加样前必须先设计好加样方案,纸上记录,建议所有样本有三个重复大剂量包装的反应试剂,使用前进行分装,尽量减少试剂的反复冻融。

 

3.3.       标准步骤:

基本流程:RNA的提取→反转录成cDNA→引物设计→Q-PCR的扩增

3.3.1.      不同样本RNA抽提:

A        组织样本:先用液氮研磨破碎或者加TRIZOL溶液后用匀浆机破碎。一般需要客户提供动植物组织30-50mg(如黄豆大小),如果组织完整需要先将其剪碎至小块状以便于匀浆,加1ml TRIZOL,根据提供的样本量以此增加或减少加入的TRIZOL量。在冰上操作,用PBS清洗匀浆棒头,晾干,伸入1.5ml EP管至TRIZOL溶液2/3处每次匀浆3-5秒,防止过热,直到明显组织块均破碎,每换一个样本匀浆都要更换匀浆棒。

B         全血样本:先以1:3-1:5(1ml样本加入3-5ml裂解液)加红细胞裂解液至样本中,室温静置10min,3500转6min,弃上清后加TRIZOL溶液。一般全血样本2-3ml对应1ml TRIZOL。

C         细胞样本:细胞一般接种孔板时用细胞计数板计数,1*105-1*106,细胞长到70-80%以上。

贴壁细胞吸掉旧的培养基,用PBS清洗两遍,加入1-2ml TRIZOL铺满孔板或培养瓶瓶底,几分钟后吹打贴壁细胞脱落裂解完全加到EP管中。

 

3.3.2 操作流程(直接法提取)

1)       以加1ml TRIZOL溶液为例,充分混匀,静置10min。

2)       4℃ 12000g离心10min,吸取上清放入新的EP管中,不要吸到沉淀。

3)       加入200ul氯仿剧烈振荡15s,然后室温静置5min。

4)       4℃ 12000g离心15min,离心液体分三层(下面是氯仿层,中间是油脂层,上面是含RNA的溶液层),小心吸取上层液体约600 ul,约为所用TRIZOL试剂的60%),转移到一个新的EP管中,不要吸到油脂层,可留少量上层液体不吸!(注意点:质量比数量更重要!)。

5)       加入等体积(约500 ul)异丙醇,轻轻混匀,室温静置10min(此步不要太剧烈震荡,上下颠倒10下左右即可)。

6)       4℃ 12000g离心10min,弃上清(将EP管倒扣在吸水纸上),沉淀用1ml75%乙醇洗涤两次(第一次加入75%乙醇后用手指将沉淀弹松并全部分散)。

7)       4℃ 7500g离心5min,弃上清,沉淀室温风干干燥5-10min(注意不要晾得太干,RNA完全干燥后很难溶解!)后用15ul-50 ul DEPC水或RNase-free ddH2O溶解得到RNA原液。迅速进行RNA浓度、纯度等鉴定

8)        马上进行逆转录反应或-80保存(尽快进行逆转录反应,长期保存需加RNA长期保存液)。

 

3.3.3 操作流程(离心柱法提取):(主要按试剂盒说明操作)。

1)       同3.3.2操作流程1)-4)。

2)       将第1)步收集的上清中加入1/2体积无水乙醇混匀。加入无水乙醇后,可能会产生半透明纤维状悬浮物,不影响提取和应用。

3)       将吸附柱放入收集管中,用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中,静置2 min,4℃ 12,000rpm 离心3 min,倒掉收集管中废液

4)       将吸附柱放回收集管中,加入500 µl 洗涤液,静置2 min,4℃ 10,000 rpm 离心30 sec,倒掉收集管中废液。

5)       重复步骤5一次。将吸附柱放回收集管中,4℃ 10,000 rpm 离心2 min。

6)  向膜中央滴加30ul-50μl RNase-free ddH2O,放置5min,12000rpm离心2min即得RNA。迅速进行RNA浓度、纯度等鉴定

7)  马上进行逆转录反应或-80保存(尽快进行逆转录反应,长期保存需加RNA长期保存液)。

 

(注意点:RNA提取中所用到的枪头,EP管都需经过DEPC处理,氯仿,无水乙醇等需为RNA提取专用)

(样品保存:加入TRIZOL匀浆后,加氯仿前,样品可在-70°C 放置一个月以上;提取的 RNA 样品可以在 70%酒精中-20°C 保存 2 星期以上;如果需要长期保存,请置超低温冰箱中保存

 

3.4.       RNA浓度测定。

3.4.1.      RNA纯度鉴定

使用微量核酸蛋白检测仪鉴定得到RNA的浓度,纯度指标(浓度以ng/ul为单位,纯度用A260/A280的比值表示,RNA的质量(包括浓度和纯度)验证:浓度以ng/ul为单位,样本组织的提取浓度>200,细胞提取的浓度>30,纯度一般A260/A2801.8-2.0之间为标准,实际实验范围可适当放宽为1.7-2.1之间。严格按照提取RNA步骤,减少盐离子的影响。

 

3.4.2.      反转录体系操作流程

Step 1:基因组DNA去除(一般根据引物设计是否跨内含子来决定是否去除基因组DNA,如果引物设计跨内含子则不需去除,直接按照Step2往下操作如何去除),去除基因组DNA按以下体系,在无核酸酶的离心管中加入以下组分

反应组成成分

体积

     3760min8010min

RNA

3μg

DNAas I(6080 U/μl)

1 μl 

10 × DNase I Buffer

1.5ul

RNase Inhibitor40units/μl

0.5ul

DEPC-ddH20

补至15 μl

Step 2:在无核酸酶的离心管中加入以下组分(如果紧接第一步反应则直接加组分至原离心管中)

  

反应组成成分

体积

15ul体系

70 10min

           RNA(去除基因组DNA

2μg

           Random Primer25um

1 μl

           DEPC-ddH20

补至15 μl

然后在冰上迅速冷却2min;

Step 3:在上述体系中再加入如下成分:

    

        反应组成成分

体积

10ul体系

30  10min42 60min70  15min

        5×M-MLV Buffer

5 μl

       PCR Nucleotide Mix10mM each

1.25 μl

       RNase Inhibitor40units/μl

1 μl

       M-MLV Reverse Transcriptase

1 μl

       DEPC-ddH2O

1.75 μl

cDNA产物在-20℃保存。

(若购买反转录试剂盒,严格按说明书操作!)

 

3.5.       引物设计(具体操作流程参见附件的视频教程)

引物使用Primer5.0 软件设计,由公司合成。

引物设计原则:

1)        PCR扩增产物长度:80-150bp最为合适(可以延伸至300bp)。     

2)       引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。

3)       G+C含量在40%~60%之间,45-55%最佳。

4)       TM值在58-68℃之间。上下游引物的TM值不能相差太大。

5)       碱基要随机分布,尽量均匀。3′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C或A/G连续结构(2-3个)。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物末端碱基为G或C。

6)       引物设计避免DNA污染,最好跨外显子接头区。

7)       一般可设计2-3对引物可供选择。预实验选出最佳引物。

8)       引物特意性验证,用blast(操作步骤见附件中的教程)。

 

3.6.       Q---PCR反应

三步法反应如下:

SYBR Premix Ex Taq

10.0ul

(20ul体系)

95 300s

95 20s

55 20s

72 20s

n=40Cycles

PCR Forward primer 10uM                       

0.4ul

PCR Reverse primer   (10uM) 

0.4ul

ROX Referene Dye(50x)

0.4ul

DNA模板cDNA 110稀释

2.0ul

DEPCddH2O                                                    

6.8ul

 (主要按SYBR Premix说明书操作!)

 

3.7.            数据分析

定量结束后,设置阈值和基线,得出Ct值,Ct值是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值,ΔCt实验组=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)实验组,ΔCt对照组= (Ct,目的基因-Ct,管家基因)对照组,ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组,2-ΔΔCt即为两组的差异。

 

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